實(shí)驗(yàn)概要:
運(yùn)用原子力顯微鏡表征3種DNA純化試劑盒對DNA的純化效果。方法：PCR擴(kuò)增K562/A02細(xì)胞mdr1基因DNA，分別以3種不同的DNA純化試劑盒對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化后，按終濃度為10 ng?μl-1固定在用1 ng?μl-1 L型多聚賴氨酸預(yù)先處理過的新剝離的云母片上，用AFM獲取DNA掃描圖像，分析評價(jià)3種DNA試劑盒對DNA的純化效果。
實(shí)驗(yàn)原理:
AFM原子力顯微鏡是具有原子級分辨率的新一代顯微鏡，因其能夠?qū)NA、蛋白質(zhì)、磷脂生物膜、多糖等生物大分子以及有機(jī)化合物的形態(tài)及功能進(jìn)行觀察研究而引起了人們的廣泛關(guān)注。近十幾年，運(yùn)用原子力顯微鏡在固相載體表面研究DNA分子技術(shù)取得的巨大進(jìn)步，大大地增進(jìn)了人們在分子層面上對DNA分子的了解。AFM原子力顯微鏡在樣本制備上相對較容易，但用于DNA研究時(shí)，要想得到質(zhì)量較高的DNA圖像對DNA樣品的純度要求較高。我們選擇了3種不同的DNA純化試劑盒對K562/A02細(xì)胞株mdr1基因769bp DNA的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化后在相同條件下用原子力顯微鏡觀測，通過比較，建議其中的兩種可用于AFM原子力顯微鏡的DNA樣品的純化。
主要試劑:
1. 含10%小牛血清的RPMI 1640(Gibco/BRL公司產(chǎn)品)培養(yǎng)液
2. 酚/氯仿
3. 1ng?μl-1 L型多聚賴氨酸(Sigma公司產(chǎn)品)
4. 瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（DP2092，TIANWEI公司產(chǎn)品）
5. DNA小量膠回收試劑盒（W5211，2408A，Waston公司產(chǎn)品）
6. 瓊脂糖凝膠DNA純化試劑盒（DV805A，TaKaRa公司產(chǎn)品）
主要設(shè)備:
1. 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱
2. 低溫冰箱
3. 紫外分光光度計(jì)
4. PCR儀
5. 紫外特?cái)z儀
6. 電泳系統(tǒng)
7. 原子力顯微鏡
實(shí)驗(yàn)步驟:
1. 細(xì)胞培養(yǎng)
K562/A02細(xì)胞株接種于含10%小牛血清的RPMI 1640(Gibco/BRL公司產(chǎn)品)培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，2~3d傳代1次，實(shí)驗(yàn)前無藥培養(yǎng)兩周。
2. DNA提取
取對數(shù)生長期、終濃度2×105ml-1的K562/A02細(xì)胞3ml，以酚/氯仿法抽DNA后，加100μl TE緩沖液于-20℃保存。用紫外分光光度計(jì)定量，要求A260/A280≥1.8。
3. PCR擴(kuò)增
從基因庫中查得所需mdr1的基因序列號，引物根據(jù)基因庫提供的基因全序列用計(jì)算機(jī)軟件Primer3設(shè)計(jì)，引物序列：上游5′ATACTTTACTCCTTCCTTCAA3′，下游5′TCTGAATAAAGTAGATTTCTTCATG3′，擴(kuò)增K562/A02 細(xì)胞mdr1基因-758～＋11的DNA，片段長度為769bp。PCR反應(yīng)體系：純化的DNA模板2.5μ1，50pmol?L-1上下游引物各1μ1，25mmol?L-1 MgCl2 1.5μ1，dNTP4μ1，5×PrimeStaRTM緩沖液(含Mg2＋)10μ1，10mmol?L-1 PrimeStaR HS DNA聚合酶0.5U，余用滅菌去離子水補(bǔ)至50μ1。熱循環(huán)參數(shù)為： 98℃變性10s，55℃退火10s，72℃延伸1min；擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)。
4. 10g?L-1瓊脂糖凝膠電泳
取10μl PCR產(chǎn)物，加2μl溴酚藍(lán)上樣緩沖液，加入3個(gè)點(diǎn)樣孔行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，在TAE電泳緩沖液中，電壓5V?cm-1，45min后取出凝膠置于紫外透射儀上顯影拍照。
5. DNA純化
在紫外特?cái)z儀下切取3條含有清晰目的ＤＮＡ條帶的凝膠塊，分別用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（DP2092，TIANWEI公司產(chǎn)品）、DNA小量膠回收試劑盒（W5211，2408A，Waston公司產(chǎn)品）及瓊脂糖凝膠DNA純化試劑盒（DV805A，TaKaRa公司產(chǎn)品）按相關(guān)說明書進(jìn)行純化，純化樣品于-20℃保存。
6. 樣本的制備
用1ng?μl-1 L型多聚賴氨酸(Sigma公司產(chǎn)品)預(yù)先處理新剝離的云母片(25px×25px)。多聚賴氨酸處理過的云母片用雙面膠帶粘附于甩膜機(jī)上，分別滴加以3種DNA純化試劑盒純化后，終濃度為10ng?μl-1的K562/A02 細(xì)胞mdr1 DNA樣品20μl于云母片中央，并在室溫下作用2min，用7000r?min-1離心，用吸量管吸1000μl去離子水滴加在旋轉(zhuǎn)的云母片中央，沖洗3遍，時(shí)間持續(xù)1min，制備成3份DNA觀測樣品。
7. AFM原子力顯微鏡觀察和分析
樣品使用原子力顯微鏡觀測，在tapping模式下操作，像素密度為512×512，操作條件是室溫、空氣中，相對濕度不超過37%。用125μm 硅針尖tapping模式下共振頻率為300~400kHz、針尖掃描頻率為 1~2Hz進(jìn)行掃描。獲取掃描圖像后，用程序軟件將圖像進(jìn)行去噪聲處理，獲得清晰的DNA圖像。通過圖像分析，評價(jià)3種試劑盒對DNA的純化效果。