英國謝菲爾德大學(xué)的S. J. Foster和J. K. Hobbs教授團(tuán)隊使用活細(xì)胞和純化的肽聚糖，應(yīng)用原子力顯微鏡對形態(tài)不同的金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌進(jìn)行了檢測?；罴?xì)胞的成熟表面以大（直徑高達(dá)60nm）、深（高達(dá)23nm）的孔隙構(gòu)成無序的肽聚糖凝膠為特征。內(nèi)肽聚糖表面由更多新生物質(zhì)組成，密度更大，聚糖鏈間距通常小于7nm。內(nèi)表面結(jié)構(gòu)取決于位置?？莶輻U菌的柱體具有密集的周向取向，而在金黃色葡萄球菌和兩個物種的分裂間隔中，肽聚糖密集但隨機(jī)取向。
將指數(shù)生長的金黃色葡萄球菌細(xì)胞固定在硅襯底上的微加工孔中，并使用小懸臂、小振幅AFM原子力顯微鏡實時成像。大型掃描重現(xiàn)了金黃色葡萄球菌的已知網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)（成熟）和環(huán)狀結(jié)構(gòu)（新顯示的分割平面）。高分辨率原子力顯微鏡顯示，網(wǎng)格是隨機(jī)定向的，寬度不同，孔隙深度高達(dá)23 nm。由于壁厚約為20 nm，一些孔隙要跨越大部分壁。壁磷壁酸或脂磷壁酸，缺乏主要的壁相關(guān)聚合物并沒有實質(zhì)性地改變結(jié)構(gòu)，這與觀察到的肽聚糖特征一致。單個股線具有可變寬度（平均6.0±3.8 nm，n=45；），在某些情況下幾個單獨的股線聚集在一起，因此認(rèn)為這些纖維通常是多分子的。肽聚糖在外壁的分布密度低得驚人。通常在11±3.4 nm（n=5）的深度處僅填充50%。因此成熟壁外部區(qū)域是多孔凝膠，即液體介質(zhì)中的三維固體網(wǎng)格。
表面環(huán)結(jié)構(gòu)（歸因于新生的間隔材料）*初是分子密集的，由徑向波紋群組成，這些波紋群由周向排列的單鏈組成，在*密集的區(qū)域間隔2.7±0.5 nm（n=16）。新生環(huán)材料中長聚糖鏈的觀察支持肽聚糖水解酶在細(xì)胞生長相關(guān)壁成熟中的作用。無序網(wǎng)格和有序環(huán)之間的界面是尖銳的。細(xì)胞分裂發(fā)生在連續(xù)的正交平面上。由于看不到與上一代細(xì)胞環(huán)正交的環(huán)結(jié)構(gòu)，在這些生長條件下細(xì)胞環(huán)在單個分裂周期內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)榫W(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。
活細(xì)胞成像**于外表面，不能區(qū)分成分。研究表明在空氣中對提取、純化的細(xì)胞壁肽聚糖進(jìn)行成像可以通過細(xì)胞周期對細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)提供有用的見解。在這里，小囊在液體中成像，敲擊固定后球囊碎片展示了活細(xì)胞環(huán)和網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。重要的是在單個球囊內(nèi)使用AFM原子力顯微鏡觀察內(nèi)表面和外表面。獲得的每個內(nèi)表面圖像（n=80）顯示出一個緊密、無序的網(wǎng)格，可能由單鏈（寬度2.8±0.8 nm，n=45）構(gòu)成，孔隙直徑小于6.4 nm（n=158）占總孔隙面積的一半，大大小于活體外表面上的孔隙（39 nm, n=310）。不完全隔面對細(xì)胞質(zhì)的表面上不存在環(huán)，而是有一個緊密、無序的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，類似于內(nèi)表面的其余部分（n=25）。環(huán)形建筑**于上一代的后分區(qū)分隔外表面。從環(huán)到網(wǎng)格的成熟可能通過表面環(huán)的丟失和重組而發(fā)生，揭示了底層無序網(wǎng)格。細(xì)胞壁的*終結(jié)構(gòu)取決于細(xì)胞壁合成酶和水解酶之間的相互作用。去除其中一種肽聚糖合成酶PBP4會導(dǎo)致更密集的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，偶爾會持續(xù)到**代表面之外。從環(huán)到多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變主要是由于肽聚糖水解酶的作用。
為了探索觀察到的普遍性對桿狀枯草桿菌進(jìn)行了研究。將指數(shù)生長的活細(xì)胞固定在細(xì)胞涂層云母上并成像。細(xì)胞柱呈現(xiàn)出無序的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有可變厚度（4.5±1.9 nm，n=111），類似于金黃色葡萄球菌，與之前提出的圓周定向特征相反。對單個細(xì)菌的連續(xù)縱向成像顯示遠(yuǎn)離兩極的結(jié)構(gòu)沒有變化。沿細(xì)胞柱觀察到15 nm深的孔隙?？莶輻U菌活細(xì)胞極由于其相對于探針尖DUAN的方向難以用原子力顯微鏡成像。然而，圓柱-磁極界面顯示了磁極相關(guān)的環(huán)形結(jié)構(gòu)。
純化枯草桿菌球囊的成像顯示圓柱體的外表面為隨機(jī)取向的網(wǎng)狀物，桿為環(huán)狀物和網(wǎng)狀物。相比之下，球囊圓筒的內(nèi)表面顯示出的特征將大致圍繞體內(nèi)圓周定向，長度范圍從明顯的單聚糖到更大的結(jié)構(gòu)，之前在中成像的樣本中被解釋為“電纜”，并且可能與cryo-EM中描述為“周向特征”的對比度有關(guān)。與螺旋組織相比單個股線的內(nèi)部方向是圍繞細(xì)胞的圓周方向。去除MreB細(xì)胞形狀決定蛋白家族產(chǎn)生的具有隨機(jī)取向鏈的球形細(xì)胞，這意味著這些成分負(fù)責(zé)這種圓周取向?？莶輻U菌不完全隔壁面向細(xì)胞質(zhì)的一側(cè)有一個無序的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，帶有隨機(jī)取向的鏈。它的表面也有明顯的氣孔。成熟極的內(nèi)表面顯示出無序、相對致密的結(jié)構(gòu)，這表明不完整間隔中的孔隙很可能是充填的，與前緣間隔合成無關(guān)。之前在干燥樣品上觀察到的更復(fù)雜的隔膜結(jié)構(gòu)可能來自脫水過程中“外部”環(huán)和“內(nèi)部”網(wǎng)施加的約束之間的相互作用。
金黃色葡萄球菌和枯草桿菌的純化成熟球囊（肽聚糖+WTA）水合時厚度分別為36±5.3nm（n=25）和34±10nm（n=19），干燥時厚度分別為17±2nm（n=25）和9±1nm（n=19）。之前的cryo EM分析顯示從活細(xì)胞到提取的水合球囊的壁厚增加了約50%。即使在面向細(xì)胞質(zhì)的壁表面上肽聚糖也有一個相對多孔的結(jié)構(gòu)，不像傳統(tǒng)的致密壁。這就提出了一個問題，即它如何發(fā)揮抑制細(xì)菌膨脹壓力的作用。為了使膨脹導(dǎo)致溶解，膜要通過壁向外膨脹，克服膜的彎曲模量。彈性變形能的計算表明，直徑為8 nm的孔可以支持約20 bar的內(nèi)部膨脹壓力，也就是說觀察到的孔足夠小，足以支持細(xì)胞膜上的預(yù)期內(nèi)部壓力。
本文提供的數(shù)據(jù)和解釋來自活細(xì)胞和在液體中成像的球囊，與之前研究中在空氣中采集的干燥球囊數(shù)據(jù)存在顯著差異。活細(xì)胞圖像顯示，成熟細(xì)胞壁是多孔的網(wǎng)狀水凝膠。液體中球囊的圖像顯示出與活細(xì)胞數(shù)據(jù)類似的特征，并且與干燥球囊相比，由于水化膨脹，厚度大幅增加。作者認(rèn)為目前的研究和以前的研究之間的顯著差異反映了干燥球囊的塌陷性質(zhì)，與含水的革蘭氏陽性細(xì)胞壁固有的3D性質(zhì)相比。這種對細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的新理解為細(xì)胞肽聚糖動力學(xué)所需的成分設(shè)置了限制。對兩種形態(tài)多樣的細(xì)菌的分析揭示了之前未觀察到的共性水平。
總之，作者使用活細(xì)胞和純化的肽聚糖，應(yīng)用AFM原子力顯微鏡對形態(tài)不同的金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌進(jìn)行了檢測?；罴?xì)胞的成熟表面以大、深的孔隙構(gòu)成無序的肽聚糖凝膠為特征。內(nèi)表面結(jié)構(gòu)取決于位置。枯草桿菌的柱體具有密集的周向取向，而在金黃色葡萄球菌和兩個物種的分裂間隔中，肽聚糖密集但隨機(jī)取向。揭示細(xì)胞外膜的分子結(jié)構(gòu)有助于理解其力學(xué)性質(zhì)和作為環(huán)境界面的作用，為傳統(tǒng)的結(jié)構(gòu)生物學(xué)方法提供補(bǔ)充信息。
參考文獻(xiàn)：
J. K. Hobbs et al. The architecture of the Gram-positive bacterial cell wall. Nature, 582, 294-297, 2020.
DOI: 10.1038/s41586-020-2236-6.
https://www.nature.com/articles/s41586-020-2236-6